A pesar de que los esfuerzos de investigación en los últimos años han dado lugar a poco o ningún aumento en el número de embriones transferibles después de la superovulación, los protocolos que controlan la emergencia de la onda folicular y el momento de la ovulación han permitido el tratamiento de grupos de donantes, sea cual fuere la etapa del ciclo estral en que se encontraban y ha permitido la inseminación artificial y la transferencia de embriones a tiempo fijo (IATF y TETF, respectivamente), sin necesidad de detectar celo.
El propósito de este trabajo es revisar los nuevos adelantos en materia producción y transferencia de embriones in vivo e in vitro aplicados a campo.
Tratamientos de superovulación para la producción de embriones in vivo
Tradicionalmente, los tratamientos de gonadotrofina se iniciaban durante la fase lútea media, de aproximadamente 9 a 11 días después del celo cercano al tiempo de emergencia de la segunda onda folicular. Sin embargo, se produjo una mayor respuesta superovulatoria cuando se iniciaron los tratamientos en el día de la emergencia de la onda folicular, en contraposición a 1 día antes, ó 1 ó 2 días después de la emergencia de la onda. Por lo tanto, los protocolos de tratamiento convencionales tienen dos inconvenientes: 1) el requisito de disponer de personal capacitado dedicado a la detección de celo, y 2) la necesidad de tener todos los donantes en estro al mismo tiempo con el fin de iniciar los tratamientos en los grupos de animales. Recientemente hemos resumido los protocolos de superovulación actuales para el ganado bovino.
Sincronización de la emergencia de la onda folicular para inducir la superovulación
En la década de 1990, se informó acerca de la sincronización de la emergencia de la onda folicular, en promedio 4 días después del tratamiento con progesterona y estradiol. Este tratamiento ha sido utilizado por los profesionales de todo el mundo para la superestimulación del ganado, pero su uso ahora ha sido restringido en varios países. Esta restricción hace que muchos profesionales de transferencia de embriones se enfrenten a un serio dilema y ha creado la necesidad de desarrollar tratamientos sin el uso de estradiol.
Una alternativa es eliminar el efecto supresor del folículo dominante por aspiración del folículo guiada por ecografía e iniciar tratamientos superestimulatorio 1 o 2 días más tarde. La desventaja de la aspiración folicular guiada por ecografía es que requiere un equipo de ultrasonido y personal capacitado, por lo que únicamente es apropiada cuando las donantes se encuentran en instalaciones de producción de embriones, es muy difícil de aplicar en el campo. Sin embargo permitiría utilizar la aspiración folicular para la producción in vitro de embriones y luego comenzar la superovulación para la producción in vivo de embriones dos días después.
Otra alternativa es el uso de la GnRH para inducir la ovulación del folículo dominante que sería seguido por emergencia de la onda folicular 1 a 2 días más tarde. Sin embargo, la aparición de una nueva onda folicular se sincronizó solamente cuando el tratamiento causó la ovulación, y sin pre-sincronización, la primera aplicación de GnRH provoca la ovulación en menos del 60% de los animales. No es sorprendente que el tratamiento con GnRH en momentos al azar del ciclo estral, antes de iniciar tratamientos superestimulatorios, dio lugar a respuestas superovulatorias más bajas que los tratamientos iniciados después de la aspiración folicular o tratamiento con estradiol. Sin embargo, en un análisis retrospectivo de los datos comerciales, Hinshaw no encontró diferencias en el número de embriones transferibles de donantes superestimuladas 4 días después del tratamiento con estradiol y progesterona y las superestimuladas 2 días después del tratamiento con GnRH. En otro estudio (Wock et al., 2008), tomó vacas lecheras tratadas con progesterona y fueron superestimuladas 4 días después de recibir estradiol ó 2 días después de GnRH; nuevamente no hubo diferencias significativas en el número de embriones transferibles entre los grupos. En otro análisis retrospectivo de datos comerciales, vacas lecheras donantes superestimuladas 60 horas después de la administración de GnRH produjeron un número similar de embriones transferibles que aquéllas superestimuladas 4 días después de recibir estradiol. A su vez las vacas tratadas con estradiol produjeron más embriones que las vacas superestimuladas entre los días 8 y 12 del ciclo estral, sin ningún tratamiento de sincronización de onda.
Recientemente hemos llevado a cabo una serie de experimentos con el objetivo general de desarrollar un protocolo de superovulación después de la ovulación inducida por GnRH con el uso de dispositivos de progesterona. Esto se basó, en parte, en un informe anterior que indicaba que la respuesta ovulatoria a la GnRH puede ser aumentada por la administración de PGF para regresar el CL en el momento de la inserción de un dispositivo con progesterona que se mantuvo colocado durante 7 a 10 días. En ese estudio, la ovulación y la emergencia de la onda se dieron consistentemente 1 a 2 días después de la administración de GnRH, lo que indica que este abordaje podría ser utilizado en grupos de donantes con ciclos al azar.
El protocolo recomendado iniciado en etapas al azar del ciclo estral consiste en la administración de PGF en el momento de la inserción de un dispositivo con progesterona para inducir la regresión del cuerpo lúteo y provocar el desarrollo de un folículo persistente. Siete días más tarde (con el dispositivo con progesterona aún colocado), se administra GnRH para inducir la ovulación y la emergencia de la onda folicular, y se inician tratamientos con FSH 36 horas después. Aunque este protocolo se diseñó para 4 días de FSH, un protocolo con 5 días de superestimulación se puede lograr simplemente retrasando la administración de la segunda dosis de PGF y la retirada del dispositivo con progesterona en un día. Aparentemente la alternativa de FSH por 5 días sería más aplicable a vacas lecheras.
En general, en esta serie de experimentos, más de 95% de los animales ovularon con la primera administración de GnRH (con la emergencia esperada de la onda folicular) y la respuesta superovulatoria y los números de óvulos/embriones y su calidad fueron similares a los obtenidos cuando la onda folicular se sincronizaba con estradiol. En un trabajo reciente se comparó este tratamiento con el que se administra GnRH 48 h después de la inserción de un dispositivo con progesterona y se comienza la superovulación 48 h después. A pesar que el tratamiento donde la GnRH se coloca 7 días después de la inserción del dispositivo con progesterona produjo 2 embriones más en promedio (14.8±1.5 vs. 12.7±1.5), las diferencias no fueron significativas.
Superovulación durante la primera onda folicular
Otra alternativa es inducir la ovulación e iniciar tratamientos superestimulatorios en el momento de emergencia de la primera onda folicular. La emergencia de la onda folicular es siempre en el momento de la ovulación, y experimentos llevados a cabo en ganado bovino y ovejas han demostrado que es posible inducir la superovulación de folículos en la primera onda folicular. Sin embargo, el éxito tras el inicio de los tratamientos superestimulatorios en el momento de aparición de la primera onda folicular se basa en la determinación del momento de la ovulación o la detección precisa del celo, ya que se espera que la ovulación ocurra 1 día después.
Para evitar la necesidad de detectar celo y ovulación en donantes Nelore (Bos indicus), Nasser y colaboradores indujeron la ovulación sincronizada con un protocolo diseñado para IATF. Se iniciaron tratamientos con FSH en el momento esperado de la ovulación (y la aparición de la primera onda folicular). Las respuestas a la superovulación no fueron distintas a las de un grupo contemporáneo superestimulado 4 días después del tratamiento con estradiol. Sin embargo, el número de embriones transferibles dependió del uso concomitante de un dispositivo de progesterona durante la superestimulación ya que en el grupo donde no se utilizó un dispositivo se obtuvieron solo ovocitos infertilizados.
Tratamientos prolongados
Durante una onda folicular normal, los folículos subordinados regresan debido a la disminución de las concentraciones de FSH circulantes, causadas por las secreciones (estradiol e inhibina) de la cohorte y especialmente del folículo dominante. Los folículos pequeños requieren FSH para continuar su crecimiento, y la evidencia sugiere que los folículos de tamaño tan reducido como de 1 mm de diámetro comenzarán su crecimiento bajo la influencia de FSH. Quizás todo lo que se requiere para reclutar los folículos para la superestimulación es hacer que estos folículos muy pequeños crezcan a un diámetro de 3 ó 4 mm, momento en el cual se puede iniciar el protocolo de tratamiento superestimulatorio común de 4 ó 5 días. Si se supone una tasa de crecimiento de 1 a 2 mm por día, esto debería llevar de 2 a 3 días, es decir, añadir 2 a 3 días al protocolo de tratamiento de superestimulación.
Por tanto, utilizando con éxito este abordaje, superestimulamos donantes en etapas al azar del ciclo estral, sin tener en cuenta la presencia de un folículo dominante. Se administraron pequeñas dosis de FSH dos veces al día durante 2 días y después se inició el protocolo de tratamiento con FSH normal sin un aumento de la cantidad total de FSH administrada. Como una alternativa, los 2 días de pre-tratamiento con FSH podían ser reemplazados por una sola inyección de eCG. En un estudio, la administración de 500 UI de eCG 2 días antes de iniciar tratamientos con FSH aumentó la respuesta a la superovulación en donantes de razas de carne. Sobre todo en donantes de razas de carne que previamente habían producido un número de embriones no satisfactorios.
Más recientemente, se ha investigado el efecto de prolongar el protocolo de tratamiento superestimulatorio tradicional de 4 días a 7 días. Alargar el protocolo de tratamiento de FSH a 7 días, sin aumentar la cantidad total de FSH administrada, aumenta el número de ovulaciones y la sincronía de las ovulaciones, y tendió a aumentar el número medio total de óvulos/embriones, óvulos fertilizados y embriones transferibles. En otras palabras, el protocolo de tratamiento superestimulatorio prolongado resultó en que más folículos llegaran a un tamaño ovulatorio y adquirieran la capacidad de ovular con un mayor número de ovulaciones, y sin disminución de la calidad de los ovocitos/embriones.
Se concluyó que los protocolos de tratamiento prolongados con FSH pueden ser una estrategia eficaz para reclutar pequeños folículos en la cohorte folicular disponible para superestimulación, mientras que proporcionan el tiempo adicional necesario para que estos folículos lleguen a un tamaño ovulatorio y adquieran la capacidad de ovular. Además, estos resultados sugieren que los protocolos de tratamiento superestimulatorio tradicionales de 4 días pueden no proporcionar un tiempo adecuado para que todos los folículos dentro de la cohorte adquieran la capacidad de ovular.
Reducción del número de tratamientos con FSH en un protocolo de superestimulación
Debido a que la vida media de la FSH hipofisaria se ha demostrado que es de 5 horas en la vaca, los protocolos tradicionales de tratamiento superestimulatorio consisten en aplicar dos inyecciones diarias de FSH hipofisiaria, durante 4 ó 5 días Esto requiere atención frecuente por parte del personal de la granja y aumenta la posibilidad de errores debido a la falta de cumplimiento. Además, los tratamientos dos veces al día pueden causar un estrés no deseado en las vacas donantes con una disminución de la respuesta superovulatoria, y/o alteración del pico preovulatorio de LH. Por lo tanto, cabe esperar que los protocolos simplificados reduzcan la manipulación de las donantes y mejoren su respuesta, sobre todo en animales menos dóciles.
Hace más de 15 años, se informó que una sola administración subcutánea de FSH en vacas de razas de carne con alta condición corporal (> 3 de 5) daba lugar a una respuesta superovulatoria equivalente al protocolo de tratamiento tradicional durante 4 días. Sin embargo, los resultados no eran repetibles en vacas Holando, que tenían menos tejido adiposo. En un estudio posterior en vacas Holando, la inyección única se dividió en dos dosis, con el 75% de la dosis de FSH administrada por vía subcutánea en el primer día de tratamiento y el 25% restante administrada 48 horas después, cuando se administra normalmente PGF. Aunque se mejoró la respuesta superovulatoria, los resultados numéricos fueron menores que con el protocolo de inyecciones dos veces al día. (Superovulación)
Una alternativa para inducir una respuesta superovulatoria repetible con una única inyección de FSH sería combinar el extracto de hipófisis con agentes que causan la liberación lenta de la hormona durante varios días. Estos agentes se conocen comúnmente como polímeros, son biodegradables y no reactivos en los tejidos, lo que facilita su uso en animales. Recientemente hemos completado una serie de experimentos en los que la FSH diluida en una solución de ácido hialurónico al 2% se administró como una única inyección intramuscular, para evitar los efectos de la condición corporal. En general, el protocolo de inyección única dio como resultado un número similar de óvulos/embriones que el protocolo tradicional de FSH dos veces al día. Sin embargo, el ácido hialurónico al 2% es muy viscoso y difícil de mezclar con FSH, especialmente en el campo. Especulamos que, aunque las preparaciones más diluidas de ácido hialurónico fueran menos eficaces que una única inyección, su uso podría mejorarse al dividirlas en dos inyecciones con 48 horas de diferencia, como habíamos mostrado previamente con inyecciones subcutáneas de FSH. El protocolo dividido de tratamiento intramuscular consistió en diluir FSH en polvo liofilizado con 10 ml de una solución de ácido hialurónico y administrar dos tercios de la dosis total de FSH en el primer día, seguido de una segunda inyección con el tercio restante de la dosis total de FSH 48 horas más tarde, momento en que normalmente se administra PGF.
Se diseñó un experimento para comparar la eficacia del protocolo de inyección intramuscular dividida de FSH en dos concentraciones diferentes de ácido hialurónico, 1% y 0,5%, (MAP-5, Vetoquinol, Canadá) con el protocolo de inyección intramuscular dos veces al día durante 4 días en el ganado bovino. En general, el número de embriones transferibles no difirió entre los grupos de tratamiento (control: 4,0 ± 0,8; 1% ácido hialurónico: 5,0 ± 0,9; 0,5% ácido hialurónico: 6.1±1.3). Se concluyó que, en el ganado bovino, la división de la dosis de FSH diluida en ácido hialurónico en dos inyecciones intramusculares con 48 horas de separación resulta en una respuesta superovulatoria comparable al protocolo de 8 inyecciones intramusculares dos veces al día. Por otra parte, las soluciones menos concentradas de ácido hialurónico no son difíciles de mezclar con FSH, incluso bajo condiciones de campo.
Gabriel A. Bó12, Martin Pelizzari1, Beatriz Bernal1, Andres Tribulo1, Felipe Ongarato1, Paula RodriguezVillamil1, Jahir Garzon1, Salvador Andrada1, RicardoTribulo1, Humberto Tribulo1, Reuben J. Mapletoft
1Instituto de Reproducción Animal Córdoba (IRAC). 2 Instituto A. P. de Ciencias Básicas y Aplicadas, Universidad de Villa María, Córdoba,Argentina. 3 Department of Large Animal Clinical Sciences, Western College of Veterinary Medicine, Canadá
