La fecundación es la culminación de una serie de eventos previos que como se vio involucran mecanismos complejos de reconocimiento celular e interacción gamética. Veamos a continuación los protocolos para una acertada fertilización in vitro.
De una adecuada maduración nuclear y citoplasmática de los ovocitos y una eficiente capacitación de los espermatozoides, depende en gran medida el éxito de esta interacción in vitro.
Una vez que disponemos de ovocitos maduros, el siguiente objetivo es lograr la fecundación de los mismos, para ello se incuban junto con espermatozoides capacitados en un medio suplementado con fuentes energéticas (piruvato, lactato) y albúmina sérica
Simular en mejor forma las condiciones naturales durante la fertilización in vitro, incluye mantener una atmósfera de CO2 (5%) y otros gases junto con una temperatura adecuada (39°C) durante la coincubación que es aproximadamente de 20 horas. Los espermatozoides criopreservados comienzan a penetrar los ovocitos maduros denudados a las 3 horas de iniciada la coincubación.
En términos generales se prepara una caja de Petri y con el semen ya capacitado y diluido a la concentración deseada, se preparan gotas para la inseminación, cubiertas con aceite mineral. Se retiran los ovocitos del medio de maduración, que estaban en la incubadora y se distribuyen por grupos, en una proporción de 10 a 30 ovocitos en 100 µl aproximadamente.
El semen empleado es generalmente congelado/descongelado de toros de alta calidad genética, aumentándose su potencial cuando se emplea semen sexado para obtener crías en función de los objetivos productivos de la explotación, como por ejemplo generar solo hembras en ganaderías de leche.
Más del 90% de los reproductores pueden emplearse en la fertilización de los ovocitos IV, ajustando adecuadamente la concentración espermática para cada toro, ya que no todos los reproductores producen un buen porcentaje de embriones.
En la figura siguiente se observa que en 15 toros utilizados en FIV, el porcentaje de preñez tuvo una variación entre 22.2% y el 80%. Así mismo al utilizar la vaca 118/2 cuyo desempeño entre los años 2008 – 2012 en un programa de FIV, su porcentaje de preñez fue de 49.5%, se aprecia que su comportamiento fue variable al utilizar diferentes toros (Gómez).
En la figura siguiente se puede apreciar que el comportamiento reproductivo del toro RADAR, en dos Haciendas con diferentes hembras, no tuvo una variación significativa en cuanto al porcentaje de preñez. (GOMEZ):
Por lo anterior se puede esperar que el comportamiento individual de un toro en particular sea constante. La fertilización In Vitro de los ovocitos maduros requiere del empleo y preparación de medios para su fertilización, incubación y mantenimiento; un equipo adecuado y protocolos específicos para su realización.
A manera de información relacionamos la adaptación de un Protocolo de Fernández et al., el cual puede aplicarse, según el criterio del profesional o el Centro de Reproducción Asistida.
DÍA – 1
Los medios para fertilización in vitro deben prepararse al menos un día antes (Día – 1) para que estén listos para ser utilizados cuando sea necesario.
HEPES –TL
HEPES-TALP
IVF-TL
IVF-TALP
Sp-TL
Sp-TALP
Materiales y equipo
- Cámara de flujo laminar.
- Microscopio
- Termo de congelación con las pajillas de los toros a utilizar.
- Termo de descongelación
- Centrifuga con 3 recipientes
- Tijeras o corta pajillas
- Embolo para impulsar el semen
- Cámara de New Bauer
- Tubos cónicos de centrifugación de 15 ml = 7
- Cajas X de 4 recipientes (nunclon) para fertilizar.
- Pipeteador de 1000 microlitros.
- Pipeteador 25 microlitro.
- Puntas para pipeteador.
- Pipetas estériles (1 X 5 ml y 1 X 2 ml)
- Pipetas Pasteur plásticas.
- Manipulador de embriones o jeringa
- Placa térmica 38.5°C
- Cajas de Petri 60 x 15.
- Toallas de papel
- Percoll ® 90%
- IVF-TALP
- HEPES-TALP
- PHE
- Alcohol
Procedimiento fertilización in vitro
Día de la fertilización = día 0
1.- Alistar el equipo y medios 2 a 3 horas antes de la fertilización.
2.- Depositar 15 ml de HEPES-TALP en un tubo cónico de 15 ml.
- Tápelos y colóquelos en la incubadora a 38.5°C
- Marque la fecha y utilícelos el mismo día.
- Parece que 4 a 5 tubos es mucho, pero algunos de estos tubos de HEPES-TALP serán utilizados más tarde durante el día.
3.- Deposite 10 ml de Sp-TALP (puede utilizarse HEPES-TALP) en un tubo cónico de 15 ml
4.- Tápelos y colóquelos en incubadora a 38.5°C y 5% de CO2.
5.- Deposite 5 ml de IVF-TALP en un tubo cónico de 15 ml.
6.- Deje la tapa suelta y colóquelo en la incubadora.
7.- Alistar las cajas X por 4 recipientes, que sean necesarias, teniendo en cuenta que se colocarán 30 CCOs maduros por recipiente.
8.- Depositar 600 microlitros de IVF-TALP por recipiente.
9.- Permitir que el medio se equilibre y entibie por 2 horas en incubadora.
10.- Colocar las cajas X en la incubadora a 38.5°C y 5% de CO2, 2 horas nates de realizar la fecundación.
11.- Depositar 3 ml de Percoll ® 90% en un tubo cónico de 15 ml.
12.- Colocar el Percoll ® 90% en incubadora a 38.5°C por lo menos 2 horas antes de procesar el semen.
13.- Conectar el descongelador para que el agua se entibie a 38°C.
14.- Colocar 1 a 2 alícuotas de PHE en la incubadora (25 µl por recipiente). Recuerde cubrir el tubo con papel de aluminio.
15.- Colocar 2 a 3 canastillas de centrífuga en la incubadora para temperarlas.
Preparacion de ovocitos para fertilización in vitro
16.- Colocar una caja X sobre la placa calentadora de láminas.
17.- Colocar 5 ml de HEPES-TALP a cada depósito.
18.- Retirar de la incubadora una o dos cajas con ovocitos maduros y colocarlas sobre la placa calentadora de láminas.
19.- Transferir los CCOs de cada microgota de MMO + suplemento a la caja X que contiene HEPES-TALP.
Para comodidad de manejo de los ovocitos maduros y aumentar la velocidad de este paso, se recomienda transferir el cotenido de 3 microgotas (30 ovocitos maduros) dentro de cada esquina de la caja X. Repetir cuanto sea necesario hasta que todos los ovocitos hayan sido colocados en las esquinas de la caja X en grupos de 30.
20.- Retirar de la incubadora la caja X de 4 recipientes con IVF-TALP pre equilibrado (600µl/depósito).
21.- Lavar los ovocitos una sola vez.
22.- Transferir un grupo de 30 ovocitos de una esquina de la caja X a un depósito de una caja de 4 recipientes.
23.- Regresar la caja X con los ovocitos a la incubadora hasta la fertilización.
Preparación del semen para fertilización in vitro
Es importante que los espermatozoides no sean expuestos a shock térmico frío, por lo que se necesita un calentador ambiental en frente del área de trabajo, en donde se procesará el semen.
También hay que estar seguros que todos los medios a utilizar con los espermatozoides estén temperados a 38.5°C, antes de su utilización mínimo dos horas antes (HEPES-TALP, Sp-TALP, IVF-TALP, PERCOLL® al 90%)
1.- Depositar 5 ml de Percoll® 90% en un tubo cónico de 15 ml
2.- Depositar en un tubo cónico Eppendorf 1.5 ml de Percoll ® 90%.
3.- Adicionar 1.5 ml de Sp-TALP para elaborar el Percoll ® 45%.
4.- Mezcle en el vortex una sola vez.
5.- Depositar 3.0 ml de Percoll 45% en un tubo Eppendorf.
6.- Con una pipeta Pasteur deposite 3 ml de Percoll® al 90%, en el fondo del tubo con el Percoll al 45%, con mucho cuidado sin mezclar los medios, creando un gradiente entre el Percoll® al 45% y el Percoll® al 90%, quedando el Percoll® 45% en la parte superior. Igualmente puede depositarse el Percoll® 90% y encima el Percoll ® al 45%
Al crearse el gradiente se forma entre ambos un menisco claro.
Si se prepara el gradiente con anticipación, éste debe utilizarse dentro de las 3 horas siguientes a su elaboración.
7.- Retirar 2 a 3 pajillas de semen del termo de congelación.
8.- Descongelar las pajillas de semen en el descongelador a 37°C por 45 a 60 segundos. Puede emplearse un baño María a 37°C. Se recomienda el baño María seco, ya que evita la formación de hongos en el medio húmedo.
9.- Seque la pajilla con una toalla o servilleta de papel absorvente.
10.- Corte la punta de la pajilla, opuesto al tapón de algodón, con las tijeras o corta pajillas.
11.- Deposite el semen sobre la superficie del gradiente de Percoll®.
Para facilitar el vaciado de las pajillas, se puede fabricar un émbolo que empuje el tapón de algodón y expulse el semen. Tenga la precaución de no enturbiar el gradiente y que el semen no pase la línea del Percoll® de 45%.
Una forma fácil y segura es poner la pajilla dentro del tubo con el gradiente de Percoll® y presionar el tapón de algodón hasta que llegue al borde del gradiente.
12.- Colocar el tubo cónico con el semen y el gradiente de Percoll® dentro de una canastilla de centrifuga temperada.
13.- Centrifugar a 300 Xg por 10 minutos.
14.- Luego de centrifugar retirar el pellet de semen formado en el fondo del tubo cónico.
Puesto que el Percoll® es tóxico para las células espermáticas la muestra de semen debe ser recolectada con un mínimo de Percoll®
15.- Deposite la fracción espermática dentro de un tubo cónico de 15 ml que contenga 10 ml de Sp-TALP y colóquela en una canastilla de centrífuga temperada.
16.- Centrifugar a 200 Xg por 5 minutos.
La velocidad exacta probablemente no sea crítica, sin embargo, hay que hacerlo a baja velocidad de centrifugación.
17.- Remover el sobrenadante con una pipeta Pasteur de plástico, teniendo el cuidado de no alterar la fracción espermática en la punta del tubo.
Este paso debe realizarse rápidamente porque los espermatozoides por su motilidad tienden a salirse de la fracción.
Si la fracción espermática se altera accidentalmente hay que parar el proceso y recentrifugar.
18.- Determinar la dilución de semen requerida de 1 millón/ml de espermatozoides.
Para realizar este paso se adicionan 10 µl de la suspensión de semen a 90 µl de agua para matar los espermatozoides.
Colocar 10 µl de la muestra en la cámara de Neubauer y contar al microscopio los espermatozoides contenidos en 5 cuadros.
Multiplicar el número de espermatozoides por 500.000 para determinar la concentración por ml.
19.- Diluir el semen adicionando IVF-TALP previamente equilibrado den la incubadora, en cantidad que permita la concentración de 4x un millón/ml.
20.- Retirar de la incubadora la caja X con los ovocitos maduros y colocarla en el calentador de láminas.
21.- Depositar 25 µl de semen diluído y 25 µl de PHE dentro de cada recipiente de la caja X
Durante el pipeteo de los espermatozoides, se debe tener el cuidado de colocar la pipeta en la mitad de la suspensión del fondo, para evitar tomar desechos que puedan asentarse en el fondo del tubo
22.- Colocar la caja X de 4 recipientes en la incubadora por 8 a 10 horas.
Para determinar la incidencia de partenogenesis o división celular, después de las 8 a 10 horas de cultivo, se colocan los ovocitos en una caja X con PHE y se cultivan por 2 días antes de observar el porcentaje de divisiones celulares.
Cultivo de embriones
Preparación de gotas de cultivo de embriones
1.- Preparar medio de cultivo para embriones (KSOM modificado) al menos 2 horas antes de remover los embriones/ovocitos de las gotas de fertilización.
2.- Entibiar el área de trabajo y el .equipo necesario de manera suficiente para evitar el shock térmico.
3.- Retirar las cajas X de 4 recipientes para FIV.
4.- Remover los embriones/ovocitos de cada recipiente. Colóquelos en un tubo de centrífuga temperado. Repetir hasta que todos los recipientes hayan sido procesados.
5.- Remover las células de los cúmulos de los embriones/ovocitos por agitación con el «vortex«, por 5 minutos.
Si es indispensable la remoción de las células del cúmulo, agitar de nuevo con el «vortex» en presencia de 300 µg/ml de Hialuronidasa.
6.- Hacer suficientes microgotas de 50 µl de medio de cultivo (30 ovocitos/embriones por gota) en cajas de Petri de 60 por 15 mm y cúbralas con aceite mineral.
Esto permitirá que los embriones no estén fuera de la incubadora por períodos prolongados. Esto es principalmente importante cuando se está aprendiendo la técnica y no se tiene suficiente practica en la clasificación de embriones.
7.- Colocar la caja X sobre el entibiador de láminas y adicionar 5 ml de HEPS-TALP en cada uno de los recipientes.
8.- Transferir los embriones/ovocitos del tubo de centrífuga a la caja X y enjuagar el tubo 3 a 4 veces con HEPES-TALP para retirar todos los embriones/ovocitos.
- Para evitar derramamiento, dejar el recipiente 1 vacío y colocar HEPES-TALP extra en el recipiente N° 4.
- Adicionar embriones/ovocitos al recipiente N°1.
- Enjuagar el tubo de centrífuga de 2 a 3 veces con HEPES-TALP del recipiente N°4
- Remover las burbujas con la pipeta, para visulizar los embriones y depositar las burbujas en el recipiente N°4, debido a que los embriones algunas veces se sitúan debajo de las burbujas.
- Lavar los embriones/ovocitos de 2 a 3 veces transfiriéndolos de un recipiente al siguiente con el propósito de limpiarlos de células y desechos.
- Finalmente, transferir los embriones/ovocitos a microgotas de Medio de cultivo pre-equilibrado (CR1aa, KSOM modificado o el medio de elección). Normalmente se depositan 30 embriones/ovocitos por microgota, pero pueden ser cultivados en otras densidades por microgota, según la disponibilidad de embriones/ovocitos (5 a 100 embriones/ovocitos).
Día 3 después de fertilización in vitro
Evaluación del porcentaje de segmentación embrionaria.
1.- Precalentar la platina del microscopio invertido, colocando un calentador cerca del microscopio por lo menos 15 minutos antes del procedimiento.
2.- Evaluar al microscopio el porcentaje de segmentación embrionaria, determinando el número de embriones segmentados dividido por el número de embriones/ovocitos depositados inicialmente en cada microgota.
3.- Regresar las cajas X a la incubadora.
Dia 7 – 9 después de fertilización in vitro
Evaluación final del desarrollo embrionario
1.- Precalentar con anterioridad la platina del microscopio invertido, con el calentador 15 minutos antes del procedimiento
2.- Evaluar el desarrollo embrionario en etapa de Blastocisto.
3.- Regresar las cajas a la incubadora.
Empacado y transferencia de embriones en fresco
1.- Selección de los embriones en estado de blastocisto aptos para transferencia.
2.- Marcado e identificación de las pajillas.
3.- Empacado del embrión.
Miguel Germán Rivera Gaona – MVZ, Esp. Reproducción.
