Un primer requisito en el proceso de preparación de los espermatozoides para la FIV bovina incluye su separación del plasma seminal, del diluyente y/o del crioprotector. Este proceso permite la selección de una subpoblación espermática que presente una buena motilidad. Entre los métodos de separación de espermatozoides bovinos se destacan la técnica de Swim-up, la Centrifugación en Gradientes de Densidad, la migración a través de una columna de ácido hialurónico y la filtración a través de lana de vidrio.
Igualmente se ha empleado en bovinos, la Técnica de Migración Sedimentación utilizada en humanos, la cual ha sido adaptada para simplificar el proceso de fertilización in vitro.
La técnica de separación espermática ideal, debe ser rápida, fácil de efectuar y separar el máximo de células espermáticas móviles, sin que ocasione ningún daño a las células aisladas.
Dado que ninguna técnica de separación de espermatozoides se comporta como método ideal, es necesario utilizar la técnica más adecuada en cada caso en particular, con el fin de obtener un número óptimo de espermatozoides competentes. Por lo tanto dependiendo de la calidad de la muestra espermática, cada método tiene una eficacia diferente.
Es esencial, por lo tanto seleccionar de la muestra del eyaculado, la mayor cantidad de espermatozoides móviles y anatómicamente funcionales, lo más pronto posible, puesto que algunos componentes del mismo alteran la capacidad de fertilización del espermatozoide. Así, los espermatozoides y leucocitos producen muchos radicales de oxígeno, que influyen negativamente la fertilidad del espermatozoide.
La elección del método de separación de espermatozoides funcionales depende de la calidad de la muestra.
La preparación de los espermatozoides para la fecundación in vitro afecta el patrón de capacitación y reacción acrosómica, de manera que pueden ser determinantes para el proceso de fecundación.
Los métodos de selección de los espermatozoides utilizados en FIV pueden afectar la proporción macho-hembra de los embriones, separando los espermatozoides de acuerdo con su cromosoma X o Y, debido a ciertas características, como diferencias de masa, motilidad o contenido de ADN.
Dentro de los factores que pueden influir el desvío en la proporción macho-hembra, el método de preparación de los espermatozoides para FIV es el más fácil de manipular, por lo que puede utilizarse para reducir la proporción de machos, determinada por otros factores que no pueden manipularse con facilidad, como la velocidad de desarrollo de acuerdo al sexo y la mayor sensibilidad de los embriones del sexo femenino a la manipulación, lo que produce un desvío menor, más próximo de lo esperado.
Técnica de SWIM UP
Mediante esta técnica se seleccionan los espermatozoides con base a su motilidad y capacidad de separación del plasma seminal. Es la técnica preferida si la muestra de semen tiene un número normal de espermatozoides (normospermia).
Si se efectúa la técnica de “Swim Up directa”, luego de la fluidificación de la muestra, el volumen total (bien mezclado) se divide en fracciones de 1 ml en los tubos de centrífuga, preferiblemente de punta cónica.
Se depositan con mucho cuidado 1.3 ml de medio de cultivo sobre el semen en cada tubo. Los tubos se colocan inclinados dentro de la incubadora, en un ángulo de 45°, incubándolos a 37°C durante 30 a 60 minutos. Al inclinar el tubo a 45° se aumenta la superficie entre el medio y el semen, mejorando la capacidad de los espematozoides para separarse del semen y alcanzar el medio. Después de esto los tubos vuelven a la posición vertical. Se retira 1 ml de la porción sobrenadante de cada tubo, aspirando los espermatozoides del menisco superior, con una pipeta estéril.
Una alternativa es la de colocar el medio de cultivo en cada tubo y depositar luego bajo el medio, el semen, con el fin de obtener una superficie más clara entre el semen y el medio.
Adicionalmente, se puede optimizar la recuperación del semen aumentando el número de tubos y disminuyendo el volumen de semen en cada tubo.
Una vez separado el sobrenadante se adiciona 2 ml de medio a cada tubo y se centrifuga a 300 rpm, por 10 minutos.
El “Swim Up indirecto”, se realiza con el pellet de semen formado por la centrifugación, seguido de la estratificación del medio sobre el pellet re-suspendido.
El semen fluidificado se divide en fracciones de 1 ml en cada tubo, adicionándose medio en proporción 1:1, y luego de centrifugar se retira suavemente el sobrenadante.
Sobre el pellet re-suspendido se adicionan cuidadosamente 1.3 ml de medio y se colocan los tubos inclinados 45° dentro de la incubadora, por 30 a 60 minutos a 37°C. Después de la migración de los espermatozoides, se hace recuento y evaluación de motilidad y se remueve el volumen de semen para IA.
En el “Swim Up directo” se efectúa la centrifugación luego de la migración de los espermatozoides, o sea, después de la separación de los espermatozoides buenos de los leucocitos y espermatozoides muertos. Estas muestras producen generalmente Especies Reactivas de Oxígeno (ROS), de tal manera que el “Swim Up directo” es el método preferido con respecto al “indirecto” para seleccionar espermatozoides para IA.
Se puede utilizar como medio DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) Sigma-Aldrich®.
Se ha determinado que el método de Swim Up produce un mayor porcentaje de embriones machos producidos in vitro, en comparación con el método de centrifugación de gradientes de densidad («Percoll«), incubados en un período de 45 minutos.
En otro trabajo se observó que a medida que aumenta el tiempo de incubación durante el Swim Up, se presentó una disminución gradual en la proporción de hembras, entre los embriones producidos. En el período más largo (50 minutos) se observó una proporción sexual de 60% de machos, aunque sin ser estadísticamente representativo.
Una explicación para esto sería la posibilidad de que los espermatozoides portadores del cromosoma X sean menos resistentes al cultivo in vitro, lo que explicaría su disminución a medida que aumenta el tiempo de incubación.
Técnica de Migración Sedimentación
Esta técnica consiste en un proceso similar al de Swim Up combinado con un paso de sedimentación, y aprovecha la capacidad de los espermatozoides para desplazarse.
Se utilizan unos tubos especiales con dos cámaras concéntricas, una central cónica de mayor profundidad, y una externa concéntrica a la anterior, a modo de galería.
El tubo cónico interior de la cámara de migración y la cámara que lo rodea se llena con medio de cultivo.
Se añade con cuidado el semen al fondo del tubo exterior, y se deja incubar el conjunto a 37ºC / 5% CO2.
Los espermatozoides nadan desde el tubo exterior al medio de cultivo contenido en el tubo interior y sedimentan en la parte cónica inferior, tras un tiempo de incubación de aproximadamente 1 hora.
A continuación se recoge el esperma del fondo del tubo cónico interior, que es el que se utilizará para las técnicas de reproducción asistida.
Esta técnica se implementó en la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad del Tolima, con asesoría de CECOLFES, los Dres. Elkin Lucena y Jorge Ramírez, en el trabajo de grado de la Dra. Luz Stella Tobar, 1984, llamado: “Capacitación espermática mediante Técnica de Migración Sedimentación”.
Una variante de la Técnica de Migración Sedimentación fue elaborada por Urrego et al., en la cual se omitió la centrifugación de los espermatozoides para los procesos de lavado y selección espermática.
Dentro de cada uno de los depósitos de los platos convencionales 4X depósitos externos, se introdujo un nuevo depósito más pequeño (depósitos internos) de aproximadamente 50 μl, hecho en material de vidrio (0.3 mm de alto por 0.8 mm de diámetro).
El procedimiento consiste en llenar los depósitos interno y externo con 700 μl de medio de fertilización, hasta que el depósito interno quede cubierto de medio; enseguida se depositan 10 CCOs por cada depósito interno; luego se depositan en el fondo del depósito externo, 30 μl de semen previamente descongelado.
Después de una hora se removió todo el contenido del depósito externo y se dejó el contenido del depósito interno con el medio y las células germinales, por un periodo de incubación de 16 h.
Los presuntos cigotos fueron cultivados en medio CR1aa por un periodo de siete días con un cambio de medio a las 72 horas. Como control, se utilizó un gradiente de Percoll 45-90% para la selección espermática.
La tasa de ovocitos divididos fue de (70.8 vs. 73.1) y la proporción de ovocitos que llegaron al estadio de mórula y blastocisto fue de (18.8 Vs 20.3), respectivamente.
Los resultados obtenidos con la nueva propuesta metodológica son similares a los obtenidos con la metodología convencional (p<0.05). Estos resultados indican que ambos métodos producen resultados similares, pero la nueva propuesta metodológica permite ahorrar tiempo, es menos laboriosa, consume menos reactivos y permite reducir la manipulación de las células espermáticas con buenos efectos eventuales en el mejoramiento de los procedimientos de reproducción in vitro.
La separación de gradientes de Percoll® permite obtener un alto número de espermatozoides móviles, siendo un método de alta repetibilidad. Con esta técnica se obtiene una tasa menor de fecundación in vitro que cuando se utiliza el sistema de Swim Up. Sin embargo, el porcentaje de blastocistos logrado en ambas técnicas es similar.
Estas diferencias en las tasas de penetración podrían ser debidas al diferente patrón de capacitación y reacción acrosómica que presentan los espermatozoides sometidos a la columna de Percoll. De este modo, la aceleración del proceso daría lugar a que un gran número de espermatozoides estuvieran capacitados más rápidamente tras la preparación por su vida media acortada, de modo que las tasas de penetración estarían reducidas.
Estos datos confirman que la preparación de los espermatozoides para la fecundación in vitro afecta al patrón de capacitación y reacción acrosómica, ya que la adición de heparina y cafeína produce un incremento significativo de espermatozoides con acrosomas reaccionados y el empleo de columnas de Percoll acelera el proceso de reacción acrosómica.
La técnica preferida es la centrifugación de gradiantes discontinuos de Percoll (45-90%) para asegurar la mayor recuperación de espermatozoides móviles. La concentración determinada de espermatozoides se diluye en bicarbonato buferado TAPL IVF con 10 mcg/ml de heparina.
Esta técnica permite mediante gradientes de densidad discontinua, la separación de los espermatozoides buenos, de los espermatozoides muertos, leucocitos y otros componentes del plasma seminal. Durante la centrifugación de la muestra a través del gradiente del silicato coloidal cubierto con sílice pueden seleccionarse las células con diferente motilidad y densidad. Los espermatozoides con alta motilidad y buena morfología están en el pellet depositado en la punta del tubo cónico, libres de espermatozoides muertos, leucocitos, bacterias y epitelio de descamación.
La mayoría de los métodos utilizan dos tipos de gradientes discontinuos, formados por una capa superior de 40% (v/v) y una capa inferior del 80% (v/v). Igualmente se emplean capas de 45 – 90%, o tres capas de 30 – 60 – 90%. Entre más capas mejor será la selección de los espermatozoides.
El medio de gradiente de densidad está disponible en productos comerciales listos para utilizar o para preparar las diferentes capas de densidad. Los gradientes se preparan adicionando al Percoll® soluciones isotónicas estéril como BWW, HAM F-10, HTF, TALP.
Una vez preparado el gradiente de densidad, se procede a la colocación de la muestra de semen, en la parte superior del gradiente. Seguidamente se centrifuga la preparación obtenida, por el tiempo estipulado en cada protocolo establecido por el laboratorio.
El tiempo y la fuerza de centrifugación pueden variar dependiendo de la calidad de la muestra; por ejemplo: el tiempo de centrifugación puede incrementarse en muestras con alta viscosidad.
Luego de la centrifugación debe retirarse suavemente la mayor cantidad de sobrenadante.
El pellet de semen en la punta del tubo cónico se diluye nuevamente en 5 ml de medio y se centrifuga a 200 rpm por 10 minutos. Finalizada la centrifugación se remueve el sobrenadante y la muestra está lista para utilizar en cualquier técnica de reproducción asistida (IA o FIV).
El procedimiento se describe con mayor detalle al hablar más adelante de la fertilización In Vitro propiamente dicha.
La técnica de Swim Up y de centrifugación de Gradientes de Densidad tienen eficiencias diferentes en la separación de los espermatozoides. Los espermatozoides aislados mediante Swim Up son limpios y móviles, con una alta integridad del ADN, pero son lesionados por las Especies Reactivas de Oxígeno (ROS). Los espermatozoides aislados por Centrifugación de Gradientes de Densidad, no son lesionados por los ROS, pero tienen una baja integridad del ADN.
Capacitación espermática
Se ha definido a la capacitación como los cambios que preparan al espermatozoide para la hiperactivación y reacción del acrosoma. Esta última es un prerrequisito para la penetración de la zona pelúcida y la fusión del espermatozoide con la membrana plasmática del ovocito, constituyendo un mecanismo de control para la fecundación.
Entre los cambios que ocurren durante la capacitación, previo a la hiperactivación y reacción acrosómica, se encuentran los siguientes: Alteración de las glicoproteínas de la superficie del espermatozoide, modificaciones de las proteínas y lípidos de la membrana plasmática al calcio y activación del sistema adenilciclasa
Las evidencias indican que para que estos cambios ocurran, es necesario el calcio extracelular, al menos parte del que es interiorizado. Se sabe que el aumento intracelular del Ca++, provoca variadas respuestas, entre ellas la estimulación de la adenil ciclasa, lo que a su vez induce un aumento en el AMPc y la activación de fosfolipasas asociadas a la membrana, con la consiguiente alteración de la membrana plasmática.
La capacitación de los espermatozoides puede realizarse mediante el uso de sustancias fisiológicas como las células del cúmulo oóforo, el fluido folicular, el fluido oviductal, la progesterona, las proteínas de la zona pelúcida y los glicosaminoglicanos como la heparina. También se han usado con éxito sustancias no fisiológicas como el ionóforo de calcio A23187.
La reacción acrosómica se puede considerar como una exocitosis en que las membranas plasmáticas y acrosómica externa se fenestran y fusionan progresivamente entre sí, permitiendo que el espermatozoide establezca una unión secundaria con la zona pelúcida, iniciando así su paso a través de ella para más tarde fusionarse con la membrana plasmática del ovocito.
Para estudiar la reacción acrosómica se ha utilizado con éxito diversas técnicas como la clásica microscopía de contraste interdiferencial, diversas tinciones y microscopía de campo claro, lectinas unidas a fluoresceína y anticuerpos monoclonales.
Tradicionalmente se ha empleado un medio de cultivo específico para cada una de las fases del sistema de producción in vitro de embriones, por lo que se busca la posibilidad de utilizar un medio único que cumpla los requisitos de cada una de las fases. Esta posibilidad facilitaría las labores y tareas en el laboratorio, y el trabajo experimental. Por otra parte, sabemos que el medio utilizado en la FIV podría tener una importancia fundamental al ejercer efectos tanto en la reacción acrosómica del espermatozoide, como en la penetrabilidad de los ovocitos y en el desarrollo embrionario posterior.
La composición del medio de FIV va a condicionar la posibilidad de desarrollo de la reacción acrosómica, fase fundamental para el proceso de fecundación en la que se produce la fusión de la membrana acrosomal externa con la membrana plasmática del espermatozoide.
En un trabajo realizado por Gardon et al., se concluyó que el porcentaje de espermatozoides intactos es superior en el medio TCM-199 (valor medio 30.93±1.18) que en TALP (28.79±1.40) o BO (26.53±1.31). La reacción acrosómica está acelerada en los medios TALP y BO en relación con el medio TCM-199, siendo el medio TALP el que induce un mayor porcentaje de espermatozoides con reacción acrosómica (valor medio TALP 9.33±0.81, TCM-199 6.76±0.64 BO 7.33±0.54), mientras que los espermatozoides cultivados en el medio TCM-199 presentan un retraso en el patrón de reacción acrosómica.
Para utilizar con más éxito el medio TCM-199 en el proceso de FIV es necesario ajustar variables como la concentración de Ca++ y de los inductores de la capacitación (heparina y cafeína) que permitan acelerar los procesos de capacitación y reacción acrosómica.
Para utilizar con más éxito el medio TCM-199 en el proceso de FIV es necesario ajustar variables como la concentración de Ca++ y de los inductores de la capacitación (heparina y cafeína) que permitan acelerar los procesos de capacitación y reacción acrosómica.
Tanto la heparina como el condroitin sulfato A, B, o C y el ácido hialurónico promueven la reacción acrosómica en espermatozoides bovinos; su acción inductora estaría relacionada al grado de sulfatación de los compuestos, siendo la heparina, el GAG (glicosaminoglicano) con mayor efecto inductor. Esta propiedad sería una acción indirecta que dispondría a los espermatozoides para responder al calcio, requisito obligatorio para que ocurra la reacción acrosómica y para activar los cambios de membrana típicos de este fenómeno.
La heparina se uniría específicamente a los espermatozoides en forma saturable, reversible, dependiente del pH, la temperatura y la concentración de calcio en el medio, promoviendo la captación de este ión por parte de las células a través de los canales iónicos provocando el incremento de los niveles de AMPc. Sin embargo, la localización del receptor de la heparina en el espermatozoide bovino, aún no ha sido bien determinada y es posible que estos eventos estén confinados a la región anterior de la cabeza del espermatozoide.
La capacitación espermática en bovinos, dada por la heparina, depende de su concentración en el medio de incubación; así, se describen tasas de fecundación in vitro sobre 70%, utilizando dosis entre 10 µg/ml a 20 µg/ml de heparina. También el tiempo de incubación afectaría la respuesta de los espermatozoides bovinos alcanzando la saturación a las 2 horas; sin embargo, la capacidad fecundante de estos se empieza a expresar después de las 2.5 horas, manifestándose plenamente cuando los espermatozoides son incubados por 4 horas.
Lo anterior refleja la importancia de los medios en la FIV, por lo que la tendencia de los profesionales de los diferentes laboratorios en los Centros de Reproducción Asistida, es la de preparar sus propios medios, ajustando las cantidades y componentes al protocolo que mejores resultados, en cuanto a índices de preñez, han obtenido.
Miguel Germán Rivera Gaona – MVZ, Esp. Reproducción.
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