La fertilización in vitro es la técnica de reproducción asistida, en donde la maduración y fecundación de los gametos femeninos, así como el desarrollo de los embriones resultantes hasta el estado de blastocisto se lleva a cabo artificialmente a nivel de laboratorio, para con posterioridad ser congelados o transferidos a una receptora en donde terminará su período de gestación, dando lugar a un nuevo individuo viable.
Al igual que la TE, la Fertilización In Vitro se ha desarrollado desde el punto de vista investigativo, requisito previo para su implementación y desarrollo a nivel comercial, objetivo final como factor de producción, productividad y valor agregado de la industria ganadera.
En el aspecto investigativo, la Fertilización In Vitro permite obtener los conocimientos básicos para entender el mismo proceso in vitro y poder afrontar otras líneas de investigación como la criopreservación de gametos y embriones, la transferencia nuclear y la producción de embriones genéticamente modificados. Igualmente, es posible la evaluación de la capacidad fecundante del semen y el diseño de diferentes protocolos de congelación y sexaje del mismo. Es una técnica que facilita la conservación de especies en vías de extinción.
La aplicación inicial de la Producción de Embriones In Vitro (PEIV) fue la obtención de embriones bovinos a gran escala, a partir de ovarios de donadoras de matadero. Como resultado de la implementación de técnicas que permiten la recolección de ovocitos de manera directa de ovarios de donadoras vivas, se ha podido introducir ampliamente la PEIV en programas de selección genética en las distintas especies.
La utilización de la PEIV para la producción comercial de embriones, presenta las siguientes ventajas:
1.- Logra un mejoramiento genético del hato en menos tiempo, acorta el período generacional, utiliza hembras de alta producción y reproductores probados.
2.- Esta técnica no altera los ciclos reproductivos de la donadora, por lo que no hay necesidad de aplicar gonadotropinas, evitando efectos secundarios por el empleo de FSH.
3.- Se logra una mayor cantidad de embriones por donante, ya que la aspiración folicular puede realizarse a intervalos cortos. Igualmente, puede realizarse en hembras gestantes o poco después del parto.
4.- La Fertilización In Vitro está indicada en hembras de alta producción que no son aptas para un proceso de TE convencional, por deformaciones anatómicas que impiden la fertilización y/o el lavado de los embriones, como el cuello en S, o que no responden al tratamiento superovulatorio MOET (Multiovulación y Transferencia de Embriones). Así mismo, está indicada en hembras que han sido eliminadas de la reproducción por afecciones que no alteran el funcionamiento ovárico, como metritis, complicaciones post quirúrgicas, lesiones podales o vacas repetidoras.
5.- La técnica permite la utilización de semen de toros costosos, ya que el número de embriones producidos por pajilla disminuye los costos del semen. Así, una pajilla es suficiente para 3 a 5 donadoras. De otra parte, cada grupo de ovocitos se pueden inseminar con un toro diferente, lo que aumenta el número de posibles combinaciones genéticas.
6.- La PEIV permite y facilita la utilización de semen sexado para la producción de hembras con una eficiencia del 90%.
Sin embargo, la FIV presenta algunos inconvenientes para el logro de resultados más satisfactorios:
1.- A pesar de los esfuerzos realizados para mejorar la eficiencia de la FIV, ésta tiene aún un bajo rendimiento, ya que el porcentaje de ovocitos capaces de transformarse en embriones transferibles, está entre el 30 – 40%.
2.- Los embriones producidos in vitro son de menor calidad que los obtenidos in vivo, existiendo entre ellos numerosas diferencias. Los embriones producidos in vitro son más oscuros y de menor densidad por su mayor contenido citoplasmático de lípidos. Tienen un menor número de blastómeras, en especial a nivel de la masa celular interna, una zona pelúcida más frágil, reducción del espacio perivitelino y mayor velocidad de desarrollo. Además, presentan alteraciones de comunicación intercelular, con una expresión anormal de las proteínas que forman las uniones Gap, un mayor contenido de triglicéridos y menor de otros lípidos, alteraciones de la expresión genética y mayor incidencia de apoptosis. Lo anterior reduce su potencial de desarrollo pre y postimplantación, lo cual origina bajos porcentajes de gestación (30-40%).
3.- Existe una mayor divergencia en el desarrollo embrionario de los obtenidos in vitro respecto de los in vivo, ya que los segundos dependen del momento de la ovulación y la fecundación; sin embargo, en el modelo in vitro el momento de la fecundación es más preciso y por lo tanto tiene una mayor sincronización.
4.- Los embriones in vitro tienen menor resistencia a la criopreservación, siendo uno de sus principales problemas, ya que la supervivencia después del congelamiento es menor que el de los embriones producidos in vivo, lo cual dificulta su conservación a largo plazo. Por lo tanto, estos embriones son transferidos preferiblemente en fresco, lo cual requiere de la sincronización de las receptoras con la producción de embriones.
5.- Nacimiento de terneros voluminosos, conocido como exceso de volumen fetal. Más del 30% de los terneros nacidos por FIV presentan un peso superior a los 50 Kg, independientemente de su raza, lo cual aumenta el porcentaje de distocias por este concepto.
A pesar de las limitaciones de la técnica, Brasil ha mostrado un fuerte impulso para reemplazar la TE por OPU/PIV. Esto se debe a una peculiaridad del ganado cebú (Bos indicus), dado que las vacas suelen tener más folículos ováricos y más ovocitos recuperados por OPU en comparación con el ganado Bos taurus. No hay ninguna explicación aparente para esta diferencia biológica intrigante. Sin embargo, la información disponible en la mayoría de OPU/PIV en Brasil, se obtuvo en Nelore, responsable de aproximadamente el 80% del rebaño. Las razas cebuinas siguen representando la mayoría de los embriones producidos en Brasil, con 94% del total.
Técnica de producción de embriones por fertilización in vitro– PEIV –
La PEIV es un método importante en el avance de áreas de investigación cuya principal limitante es el alto costo de la producción convencional de embriones. Desde el punto de vista comercial, se emplea para acelerar la producción de animales genéticamente superiores. Comprende para su realización de los siguientes pasos:
1.- Recolección de ovocitos
2.- Selección de ovocitos
3.- Transporte y maduración de ovocitos
4.- Capacitación espermática
5.- Fertilización gamética
6.- Selección de embriones
7.- Transplante de embriones
Recolección de ovocitos
La recolección de ovocitos puede realizarse a partir ovarios de hembras donadoras de matadero o en donadoras vivas mediante procedimientos quirúrgicos, laparoscópicos o aspiración folicular transvaginal (OPU).
Recolección de donadoras de matadero
La obtención de ovarios de hembras de matadero es la forma más común y económica para la recolección de ovocitos con fines experimentales en el proceso de FIV. Es el método que ha permitido el desarrollo de la producción in vitro de embriones bovinos y la que dio comienzo a la producción de embriones a gran escala.
Los ovarios deben ser obtenidos enseguida del sangrado de los animales, efectuándose un primer lavado con solución salina para eliminar la sangre y adherencias. El transporte puede hacerse en solución salina o PBS con antibióticos a temperatura ambiente.
Yang y col. fueron los primeros en estudiar el tiempo de conservación de los ovarios a 24-25°C. Los autores observaron que el transporte de los ovarios durante 11 horas no disminuyó la vitalidad de los oocitos obtenidos, lo cual constituye un aspecto práctico importante al permitir el procesamiento de material recolectado a grandes distancias.
Sin embargo, las temperaturas ambientales entre 30°C y 35°C alteran el tiempo de procesamiento el cual debe hacerse dentro de las 2 horas de su obtención. Cuando los ovarios se conservan durante 24 horas a 21°C, 18°C y 15°C, los porcentajes de división y de blastocistos no fueron diferentes del grupo a 25°C durante 4 horas. La refrigeración de los ovarios a 4°C durante 12 – 24 horas no afectó la tasa de división.
Una vez llegan los ovarios al laboratorio deben procesarse en condiciones asépticas y bajo una cámara de flujo laminar. Se lavan 3 veces en medio de transporte, se secan con gasa o papel absorbente estéril, se depositan en recipientes térmicos que contienen solución salina o PBS con antibióticos (Penicilina G sódica 100 UI/ml + 100 mg/ml de Sulfato de Estreptomicina) y se procede a la obtención de los ovocitos para el proceso de FIV (REA). Se efectúa mediante disección o cortes ováricos (Slicing), o aspiración de los folículos.
Técnica de disección
Técnica de disección ovárica Slicing
La técnica de disección tiene la ventaja de permitir el aislamiento individual de los folículos, determinando su tamaño antes de la recolección de todos los ovocitos, con el fin de asegurar la máxima recuperación de ovocitos competentes de cualquier donadora.
Miguel Germán Rivera Gaona – MVZ, Esp. Reproducción
Nota: Seguir artículo: «Aspiración folicular: cómo se hace» en sección BIOTECNOLOGÍA.