El plasma seminal consiste en una compleja mezcla de secreciones que se originan principalmente en el tejido testicular, epidídimo y las glándulas sexuales accesorias.
La comprensión del proceso fisiológico reproductivo con miras a incrementar la eficiencia del sistema de producción animal, ha sido el objetivo de la investigación en torno al ovocito y al espermatozoide, los cuales son los responsables de la conservación y multiplicación de las especies. Se ha evidenciado que la participación del macho en los índices reproductivos podría ser modificada por procesos multifactoriales complejos que inciden en el adecuado funcionamiento espermático, y por tanto en el delicado proceso de la fecundación.
El plasma seminal consiste en una compleja mezcla de secreciones que se originan principalmente en el tejido testicular, epidídimo y las glándulas sexuales accesorias. Este plasma cumple un rol protector espermático dentro del tracto reproductivo de la hembra, ya que modula la respuesta inflamatoria tras la monta (suprime la activación del sistema del complemento, la quimiotaxis de neutrófilos “PMN” y la fagocitosis); sus proteínas protegen selectivamente a los espermatozoides vivos para no ser fagocitados por los PMN presentes en el útero y juega un rol importante en el transporte y eliminación de espermatozoides muertos. Igualmente participa de manera importante en la maduración final del espermatozoide a través de cambios hormonales, enzimáticos y de modificación de la superficie de membrana espermática; además de servir como vehículo para los espermatozoides eyaculados. La enorme variación de la calidad espermática existente entre machos de una misma especie o entre razas puede atribuirse en parte a diferencias en la composición proteica de su plasma seminal.
El espermatozoide eyaculado no posee capacidad fertilizante característica que la adquiere durante el tránsito a través del tracto genital de la hembra, algunas de las proteínas contenidas en el plasma seminal, se unen a la célula espermática al momento de la eyaculación gracias a su afinidad con los lípidos presentes en la membrana plasmática, provocando una reconfiguración en la estructura de la misma, proceso conocido como decapacitación espermática.
Una considerable serie de estudios en bovinos se han encaminado al análisis de un grupo de proteínas ácidas del plasma seminal, llamadas proteínas BSP (Bovine Seminal Plasma – Proteinas del plasma seminal bovino), las cuales se adsorben a la membrana plasmática del espermatozoide en el momento de la eyaculación y tienen un papel crucial en la capacitación del espermatozoide. Estas proteínas, son secretadas por las vesículas seminales y están caracterizadas con respecto a sus propiedades bioquímicas y estructurales. Las BSP A1, A2 y A3, tienen pesos moleculares entre 15.000 y 16.500 Dalton y se sabe que incrementan significativamente la motilidad del espermatozoide cuando se unen a la parte media del mismo.
Plasma seminal
El plasma seminal esta formado por una compleja mezcla de secreciones que se originan principalmente en el epidídimo y las glándulas sexuales accesorias “vesículas seminales, ampolla, próstata, glándulas bulbo uretrales”. Este plasma tiene múltiples funciones entre las cuales se destaca la de servir como vehículo para transportar los espermatozoides en el eyaculado; sirve de protección espermática ya que contiene inhibidores de la respuesta inmune que cubren los espermatozoides modulando de esta forma la respuesta inflamatoria tras la monta y generada por las hormonas esteroideas, suprime la activación del sistema del complemento, la quimiotaxis de polimorfonucleares neutrófilos “PMN” y la fagocitosis, igualmente sus proteínas protegen selectivamente a los espermatozoides vivos para no ser fagocitados por los PMN presentes en el útero y juega un rol importante en el transporte y eliminación de espermatozoides muertos. Adicionalmente de manera importante participa en la maduración final del espermatozoide a través de cambios hormonales, enzimáticos modificando de esta manera la superficie de la membrana espermática.
A través de acciones multifuncionales de componentes orgánicos e inorgánicos presentes en el plasma, se puede inhibir o estimular la función espermática y su fecundidad; así, el plasma seminal ejerce sobre los espermatozoides funciones que se refieren principalmente a nutrición, protección, regulación de la motilidad, capacitación espermática, reconocimiento y unión entre gametos y de una manera indirecta su acción sobre el tracto genital de la hembra para producir incremento de las contracciones uterinas (presencia de hormonas esteroideas y prostaglandinas), modulación de la respuesta inmune y una relajación del istmo oviductal.
El pH del plasma seminal en las especies domesticas varía desde 6.7 hasta 7.4 (predominando valores hacia la neutralidad) y tiene el potencial para neutralizar el pH ácido vaginal. Durante el apareamiento, el pH cambia de 4.3 a 7.2 dentro de los 8 segundos de la llegada del espermatozoide.
La eyaculación del macho se lleva a cabo en distintas fracciones característica dependiente de cada especie, su composición esta determinada por el aporte en distintos momentos de las glándulas sexuales anexas, lo cual permite comprender la variabilidad en la composición del plasma seminal entre individuos de la misma especie, eyaculados del mismo individuo, por efecto del estado fisiológico, por influencia del medio ambiente, como ocurre en los países estacionales, por el estado nutricional o por estrés climático. En cerdos, por ejemplo, se presentan variaciones en las diferentes fracciones del plasma seminal dentro de un mismo eyaculado. Investigaciones donde preincubaron espermatozoides con diferentes fracciones del plasma seminal han encontrado diferencias en los porcentajes de penetración in vitro, siendo la primera fracción del eyaculado la de mejores resultados frente a las otras fracciones. Estas variaciones posiblemente están relacionadas con los diferentes perfiles proteicos de cada fracción del eyaculado.
Figura 1. Plasma seminal y capacidad fecundante del espermatozoide. Tomado de Cardozo, 2005.
La composición definitiva del plasma seminal puede variar inmediatamente tras la eyaculación, debido a que ciertos componentes plasmáticos se adhieren al espermatozoide y también a que algunos componentes celulares abandonan la célula debido a la gran permeabilidad de su membrana. Esta variación en la composición del eyaculado sería una de las causas existentes para la gran variabilidad de respuesta en cuanto a la preservación de semen que existe entre los distintos machos de una misma especie; de acuerdo a esto, se ha evidenciado que la centrifugación y remoción de todo el plasma seminal resulta en una reducción significativa en la motilidad de los espermatozoides almacenados en refrigeración cuando se utilizan diluyentes estándar, en otros estudios se evidenció que la remoción parcial del plasma seminal previo a su almacenamiento a 5°C resulta en una mejoría en las características de motilidad, característica que podría sugerir que es esencial una baja concentración de plasma seminal en el tracto reproductivo de la hembra, lo cual conllevaría al mantenimiento de las características de motilidad espermática.
En los últimos años se ha determinado que el plasma seminal bovino (BSP: bovine seminal plasma) contiene una familia de proteínas que son secretadas por las vesículas seminales y se ha descrito que estas proteínas también se presentan en las demás especies de mamíferos, variando en su concentración; en el toro, por ejemplo estas proteínas representan el 65% del total de proteínas del semen, en el potro se han caracterizado 8 proteínas de plasma seminal (HSP – 1 a HSP – 8), siendo las más abundantes HSP – 1 y HSP – 2, (renombradas SP1 y SP2) que representan entre un 70 y un 80% del total de proteínas presentes en el plasma seminal. También se ha demostrado que estas BSP se involucran en el establecimiento del reservorio espermático a nivel oviductal modulando el proceso de capacitación y participan en algunos eventos centrales dentro de la fertilización (fusión entre el espermatozoide y el ovocito).
Proteínas del plasma seminal
Las proteinas del plasma seminal participan en procesos relacionados con la proteccion espermatica durante su transito y almacenamiento en el epidídimo, en el eyaculado y durante el transito inicial en el útero. A pesar de que el proceso de formación de especies reactivas de oxigeno (ROS) desempeñan funciones importantes en la fisiología espermática un desequilibrio en su formación podría conllevar a estrés oxidativo lo que lleva a disturbios funcionales en el espermatozoide, por medio de mecanismos como peroxidacion lipídica, reducción de la actividad de enzimas reguladoras de influjo de calcio a la membrana y perdida de ATP. Para combatir este efecto deletéreo del ROS sobre los espermatozoides, el epidídimo secreta enzimas antioxidantes, dentro de las cuales se encuentra la glutationa S- transferasa, tioredoxina peroxidasa, superóxido dismutasa, glutation peroxidasa y catalasa. La glutationa peroxidasa (GSHPx) constituye uno de los dos principales medios enzimáticos de proteccion espermática, estando presente en el fluido epididimário. La GSHPx posee un residuo conocido como selenocisteína que catalisa la reduçion de moléculas de peróxido de hidrogeno; aumentos de esta enzima aumenta la atividad en semen de ovejos y ha sido asociada a una atividad antioxidante en el fluido seminal, manteniendo de esta manera la viabilidad espermática. De forma semejante, la proteína conocida como acidic seminal fluid protein (aSFP), membro de la família de las espermadesinas es secretada por las glándulas sexuales accesorias y el epidídimo; esta posee un importante papel de control del estrés oxidativo en el tracto reproductor del macho.
La albumina (sintetizadas en el hígado, constituidas por una sola cadena de 610 aminoácidos – actúa como molécula transportadora para bilirrubina, ácidos grasos, oligoelementos) seminal posee la capacidad de absorber peróxidos de lípidos, contribuyendo con un efecto protector de la membrana espermática. Otra proteína con funciones protectoras es la Clusterina la cual actua como chaperona, solubilizando proteínas parcialmente desestructuradas y reduciendo la citotoxicidad proteica inducida por el estrés celular. Algunas otras funciones de la clusterina en el epidídimo están relacionadas con la maduración espermática y el transporte de lípidos. La clusterina también ha sido asociada a la inhibición de algunas sustancias secretadas en el útero, colaborando de esta manera con la viabilidad espermática durante el trayecto por el útero. Una correlación positiva entre clusterina del plasma seminal y la congelabilidad de semen sugiere que esta proteína ejerce un efecto sobre el transporte y redistribución de lípidos, reduciendo los daños en la membrana espermática durante el proceso de cripreservacion. Otros estudios sugieren que la clusterina y la albumina del fluido de las glándulas sexuales accesorias de toros se correlaciona con la capacidad fecundante de espermatozoides tratados In vitro.
En bovinos se ha encontrado que tras la eyaculación, las BSP (proteinas del plasma seminal bovino) interaccionan con los fosfolípidos de colina de la membrana del espermatozoide y recubren su superficie, localizándose principalmente en la pieza intermedia del flagelo y cabeza, aunque en ésta se redistribuyen heterogéneamente lo que evita el movimiento libre de los fosfolípidos y estabiliza la membrana. De otra parte se ha sugerido que el colesterol modula la interacción de la BSP-A1/A2 con los fosfolípidos de membrana. Las BSPA1/A2 y-A3 contienen en su secuencia dos dominios de fibronectina tipo II (fibronectin gelatin binding domains), presente en otras proteínas, y que les confiere la capacidad de unión a colagenasas, fibrinógeno, heparina, calmodulina, apo-AI, lipoproteínas de alta densidad (HDL) etc. Entre estas moléculas la heparina y las HDL, presentes en el tracto reproductor femenino, desempeñan un papel importante en la capacitación espermatica.
Tambien se ha demostrado que las BSP modulan la capacitación mediada por las HDL, e inducen por sí mismas la salida del colesterol. Igualmente se ha identificado la PDC-109 (BSP-A1/A2) como una proteína de unión a fucosa que podría participar en la formación del reservorio oviductal. Esto concuerda con la pérdida de afinidad de espermatozoides capacitados por el oviducto, que se debería a la eliminación de estas proteínas de la membrana espermática durante la capacitación.
Otras proteínas están relacionadas con la fertilidad del esperma, aunque su función exacta no esté bien determinada. Así, se han identificado dos proteínas en plasma seminal de toros de alta fertilidad, (proteinas de 26 kDa y 55 kDa), caracterizadas como una sintasa tipo lipocalina y osteopontina, respectivamente. Asimismo, se han identificado en el plasma seminal equino cuatro proteínas que correlacionan significativamente con la fertilidad “SP-1, SP-2, SP-3 y SP-4”. Dentro del grupo de proteínas que unen heparina, denominadas HBPs, presentes en el plasma seminal bovino, se han identificado proteínas cuya presencia sobre el espermatozoide es indicativa de la fertilidad de una muestra. Entre ellas, la proteína FAA (antígeno asociado a la fertilidad, proteína de 31 kDa indicativa de alta fertilidad de toros en inseminación artificial).
Entre las proteínas del PS implicadas en la capacitación, se han estudiado en ratón, la calcitonina, la angiotensina II y el péptido promotor de la fertilidad (FPP), anteriormente citado. Las tres estimulan la capacitación, probablemente por la misma vía, que implicaría la AC/cAMP. Tambien se ha identificado una glicoproteína presente en las secreciones de las vesículas seminales en ratón, la SVA, (seminal vesicle autoantigen), que une Zn2+, y se une a los fosfolípidos de la membrana suprimiendo la motilidad, así como otros eventos implicados en la capacitación, tales como la hiperactivación, y la fosforilación de residuos tirosina.
El plasma seminal contiene así mismo proteínas implicadas en la regulación de la exocitosis acrosomal, como la proteinasa denominada caltrina (calcium transport inhibitor), identificada en cobaya, rata, ratón y toro, que se localiza sobre el acrosoma del espermatozoide e inhibe la actividad de la acrosina en la exocitosis, así como la adquisición de Ca2+ por parte de espermatozoides epididimales en la especie bovina. Otra proteína que parece estar implicada en este proceso es la seminalplasmina (SPLN), proteína antimicrobiana secretada por las glándulas accesorias, y que interacciona con las membranas espermáticas provocando un aumento en su fluidez, que pudiera estar relacionado con la preparación de la célula para la reacción acrosómica.
Proteínas asociadas a la motilidad espermática del plasma seminal
El plasma seminal posee componentes capaces de modular la motilidad espermática, dentro de los cuales esta el sistema enzimático calicreina – cininas. Este sistema presente en el plasma seminal actúa como sustrato específico, produciendo cininas que son los principales efectores de estimulo de motilidad espermática después de la eyaculación. Estudios han demostrado correlación positiva entre gran actividad de la calicreina en el plasma seminal y la motilidad de la célula espermática. Otro componente seminal relacionado al sistema de calicreinas es la enzima convertidora de angiotensina “ECA”, la cual cataliza la formación de angiotensina II, intensificando los eventos relacionados con la motilidad espermática. La actividad de “ECA” en el plasma seminal de carneros se ha correlacionado positivamente con la concentración espermática y su fertilidad.
Figura 2. Modelo de los eventos moleculares que inducen la activación y la hiperactivación del flagelo. Tomado de Olivera et al., 2006.
Proteínas relacionadas con la capacitación espermática del plasma seminal
Las proteínas de enlace de fosfolípidos denominadas en conjunto BSPs (Binder of Sperm Proteins), se encuentran presentes en el plasma seminal de varias especies como en bovinos caprinos y ovinos. Estas proteínas son secretadas por las glándulas sexuales accesorias y representan en el toro el 35% del total de las proteínas en el plasma seminal. Las BSPs están compuestas de peptídios de cadena única y presentan dos dominios semejantes a la fibronectina tipo II, característica que le confiere la capacidad de ligarse a los fosfolípidos. Estudios han demostrado que las BSPs se unen a los espermatozoides en el momento de la eyaculación, promoviendo de esta manera la remoción de fosfolípidos y colesterol, lo que resulta en la disminución de la proporción colesterol fosfolipido, lo cual es requisito para la capacitación de la celula espermática. Igualmente se ha evidenciado que estas proteínas permanecen unidas a la membrana espermática durante el trayecto del espermatozoide en el tratcto reprodcutivo de la hembra; cuando la célula espermática llega al oviducto ayuda en la interacción entre el esperma y el epitelio del oviducto.
Figura 3. Proteína asociada a la capacitación espermatica. Tomado de Barajas, 2013.
Proteínas relacionadas con la reacción acrosomica, fertilización y desarrollo embrionario
La fosfolipasa A2 (PLA2) del plasma seminal desempeña funciones importantes en la capacitación, reacción acrosomica y en las etapas iniciales del proceso de fecundacion, incluida la fusión entre el espermatozoide y el ovocito. Esta enzima también podría tener efecto antimicrobiano en el plasma seminal, y su expresión presenta correlación con la fertilidad.
La habilidad del espermatozoide de unirse a la zona pelúcida, de penetrar y fecundar el ovocito es adquirida durante el transito epididimário. Las modificaciones ocurridas durante la maduración espermática ocurren por medio de una exposición secuencial y sincronizada de las células con los diferentes componentes del fluido del epidídimo. Antes de que el espermatozoide llegue al sitio de fecundacion, durante su transito epididimario la membrana plasmática del espermatozoide sufre cambios intra y extracelulares, como proteólisis y modificaciones de glicoconjugados en la superficie celular. En el fluido de la cola del epidídimo se encuentra gran concentración de β-galactosidasas, y una serie de glicosidasas, lo cual ayuda a la maduración espermática. Estas proteínas modifican glicoproteínas presentes en la membrana espermática.
Figura 4. interacción de gametos durante la fecundación. Tomado de Rego et al., 2010.
El análisis proteomico del plasma seminal de toros Bos taurus evidencio la expresión de una proteína denominada osteopontina (OPN), la cual presenta una significativa asociación con los índices de fertilidad medidos por medio de la tasa de no retorno a celo en vacas inseminadas y en experimentos de fertilización In vitro. La OPN, también conocida como fosfoproteína secretada 1 (SPP1), es una proteína acida con un peso molecular entre 25 a 75 kDa, rica en ácidos aspártico y glutâmico, e inicialmente aislada del tejido óseo bovino. La OPN posee funciones como adhesión celular, lo que sugiere su participación en la interacción espermatozoide ovocito, la remodelación de membranas, alteración del citoesqueleto y modulación del sistema inmune. Estructuralmente, la OPN presenta una secuencia RGD (arginina, glicina y aspartato) conservando su capacidad para unirse a integrinas, sitios de unión para la OPN en los espermatozoides. Una hipótesis acerca del mecanismo de acción de la OPN en la fecundacion se basa en el concepto de que durante la eyaculación la OPN proveniente del fluido de las glándulas sexuales accesorias se une a la membrana de los espermatozoides a través de integrinas, formando el complejo OPN-integrina que interactúa con receptores en la membrana del ovocito. Adicionalmente, la OPN también se une al receptor CD44 por medio de un domínio distinto de secuencia RGD, en este receptor, generalmente, participan dos procesos de adhesión celular y se expresa tanto en la membrana de los espermatozoides como en el ovocito.
La incubación de ovocitos bovinos en fluido de oviducto, obtenido durante la fase folicular, adicionado de anticuerpos contra la isoforma de 36 kDa de OPN, reduce significativamente la capacidad de los espermatozoides de ligarse a la zona pelucida. Es probable que, además de actuar en el proceso de interacción de gametos durante la fecundacion, la OPN active cascadas de señalización intracelulares que promueven el desarrollo embrionario, lo que explica, en parte, su asociación con las tasas de fertilidad de los reproductores.
La reestructuración de la matriz extracelular es otro acontecimiento importante en la interacción espermatozoide-ovocito, y las proteínas implicadas en estos procesos y sus respectivos inhibidores, tienen funciones importantes. En este contexto las “matrix metaloproteinasas” y sus inhibidores, las TIMPs (tissue inhibitor of matrix metalloproteinases), también han sido descritas en el plasma seminal de varias especies. La expresión de TIMP-2 en el plasma seminal de bovinos presenta también una asociación con la fertilidad de toros, aunque sus funciones aun no son muy claras.
Proteínas relacionadas a la membrana plasmática
A pesar de sus similares propiedades biofísicas, las proteínas de la membrana del espermatozoide presentan una gran diversidad tanto en su lugar de síntesis, como en su lugar de asociación a la membrana, y en su función específica; entre las funciones que pueden desempeñar se encuentran las de transportadores, canales, enzimas, receptores y elementos del citoesqueleto. Las proteínas de la superficie espermática juegan un papel crucial en la fecundación y pueden estar implicadas en multitud de funciones relacionadas como: la adquisición de la motilidad, la unión a las células del epitelio oviductal en el tracto reproductor femenino, la capacitación y subsiguiente reacción acrosómica, la unión a las células del cummulus o a la zona pelúcida y su penetración, y por último, la unión con la membrana plasmática del ovocito y su fusión. La mayoría de estas interacciones parecen mostrar relativa o absoluta especificidad de especie y de célula.
Las proteínas presentes en la membrana pueden clasificarse en integrales, con un dominio hidrofóbico (en la zona central de la bicapa) y un dominio hidrofílico, (expuesto al citoplasma o al medio extracelular) y periféricas. Las proteínas integrales, pueden difundir libremente por la bicapa o bien permanecer ancladas por interacciones proteína-proteína o proteínalípido y son muy importantes en el transporte y la transducción de señales; las periféricas están asociadas a la superficie, donde forman un esqueleto de membrana mediante interacciones con proteínas integrales específicas. Esto conlleva el mantenimiento de la forma celular y define la distribución de las proteínas integrales.
Hay que tener presente que la composición proteica de la membrana del espermatozoide está sujeta a constantes modificaciones. Así, las proteínas de membrana sintetizadas durante la espermiogénesis, pueden perderse o enmascararse durante el proceso de maduración a lo largo del tracto reproductor masculino, ser reemplazadas por otras nuevas, reorganizarse o cambiar de localización. Además, no hay que olvidar que otras muchas pertenecen al plasma seminal secretado por las glándulas accesorias y pasan a formar parte del espermatozoide tras la eyaculación. A su vez, durante su tránsito en el tracto reproductor femenino, estas proteínas pueden modificarse o eliminarse, como en el caso de algunos factores descapacitantes.
Algunas proteínas tienen la función de estabilizar la membrana hasta el momento adecuado, mientras que otras contribuyen a la pérdida de la membrana, es decir, a la exocitosis. Del equilibrio entre la acción de estas proteínas depende que la capacitación se produzca en el momento oportuno.
Se ha descrito que algunas proteínas del plasma seminal (PPS) como las denominadas BSP (bovine seminal plasma proteins) en la especie bovina se adhieren a la superficie del espermatozoide tras la eyaculación; estas proteínas participan en la capacitación, mediando la salida de colesterol de la membrana y en el caso de las BSPs su unión a la superficie del espermatozoide, se pierde tras la interacción de éste con las células epiteliales del oviducto. También se ha descrito en la superficie espermática de bovino un receptor del factor I de crecimiento semejante a la insulina (IGF-I) que estimula la motilidad y está implicado en el proceso de fecundación.
En cuanto a las proteínas implicadas en las interacciones espermatozoide-ovocito, se ha propuesto un gran número de proteínas espermáticas como receptores específicos de las glicoproteínas de la zona pelúcida (ZP) del ovocito. Se denominan genéricamente proteínas de unión al ovocito (eggbinding proteins o EBPs) y pueden clasificarse en dos grupos, según estén implicadas en la unión primaria o secundaria con la zona pelúcida. Las implicadas en la unión primaria se localizan en el segmento principal de la membrana plasmática, recubriendo el acrosoma, y se pierden como consecuencia de la exocitosis acrosomal. Tras la capacitación aumenta la afinidad de unión a la ZP de los receptores implicados en la unión primaria; esto puede atribuirse a cambios conformacionales, que incluyen la dimerización de receptores, o el desenmascaramiento de receptores de la ZP. La unión a la ZP conduce instantáneamente a la reacción acrosómica, por lo que se ha propuesto que algunas de estas proteínas integrales implicadas en la unión primaria poseen un dominio extracelular que es el sitio de unión a la ZP, y un dominio citosólico, que actúa como activador de las vías de transducción de señales intracelulares en la reacción acrosómica.
Comentario final
Se evidencia que existe escasa capacidad biosintética de los espermatozoides, de acuerdo a esto uno de los mecanismos por los que tiene lugar los cambios necesarios para que la célula espermática cumpla su función es la adquisición de nuevos componentes presentes en el plasma seminal, los cules cumplen multiples funciones desencadenado en funcionalidad fecundante.
La presencia de cierto componentes (Proteinas) específicos de plasma seminal y/o membrana plasmática podrian ser utiles como indicadores de la capacidad fecundante del macho; de esta menera se podria contribuir a decartar individuos infértiles o de baja fertilidad, lo que conllevaria a la mejora de los flujos productivos en los sistemas dedicados a la produccion animal.
Néstor Isaías Tovío Luna 1; Laura Angelica Bernal Quintero 2
1 Zootecnista, MSc., PhD (e), Docente Fucultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia Universdad Nacional de Colombia; Facultad de Ciencias Agropecuarias Universidad de La Salle. 2, Médico Veterinario Especialista en Reproducción Bovina Tropical y Transferencia de Embriones, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad de Ciencias Aplicadas y Ambientales UDCA.
