Los ovocitos una vez retirados de los ovarios, no están aptos aún para ser fecundados y comenzar el desarrollo embrionario inicial, por lo que es necesario que sufran una serie de modificaciones estructurales y bioquímicas en el núcleo: Maduración nuclear y citoplasmática – Maduración citoplasmática, para poder adquirir la capacidad de ser fecundado, lo que en conjunto se denomina maduración ovocitaria. Veamos entonces los pasos de cómo se hace la maduración de ovocitos.
La maduración del ovocito es la última de una serie de etapas que debe atravesar una célula germinal femenina para adquirir la capacidad de ser fecundada y dar origen a un nuevo individuo. Durante esta última etapa el ovocito sufre profundos cambios a nivel nuclear y citoplasmáticos que son regulados paracrinamente por una compleja comunicación bidireccional con las células somáticas que lo rodean. Esta regulación local es coordinada por factores endocrinos que son secretados en forma cíclica. Como resultado de la interacción entre los diferentes niveles de regulación, paracrina y endocrina, solo unos pocos ovocitos son seleccionados para iniciar la etapa de maduración a lo largo de la vida fértil, mientras que la mayor parte degeneran en atresia. Al final de la etapa de maduración ocurre la ovulación, y el ovocito es, durante un corto período de tiempo, una célula completamente competente capaz de dar origen a un nuevo individuo si es fecundada en un momento determinado.
La maduración nuclear y citoplasmática debe ocurrir simultáneamente confiriéndole a los ovocitos la capacidad de ser fecundados, además de poder descondensar la cabeza del espermatozoide, formar los pronúcleos y el desarrollo normal del embrión.
Los eventos nucleares consisten en la reorganización de la red de microtúbulos, rompimiento del envoltorio nuclear, descondensación de los cromosomas y progresión a la Metafase I, Anafase I, Telofase I, expulsión del primer cuerpo polar y llegar al estado de Metafase II.
En cuanto al citoplasma, ocurre la reprogramación de la síntesis proteica, así como la activación de la proteinquinasa por los Mitógenos (MAPK) y el Factor Promotor de la Maduración (MPF). Igualmente se desencadenan los mecanismos de liberación de Ca++ y la adquisición de la capacidad de descondensar la cabeza del espermatozoide.
Además durante este período ocurren cambios en la reorganización del citoplasma tales como el desarrollo continuo de los niveles lipídicos, reducción del aparato de Golgi, aparición de los ribosomas adyacentes a los cromosomas, migración de las mitocondrias y alineamiento de los gránulos corticales próximos a la membrana plasmática. El aumento de los niveles lipídicos está asociado a la formación de un pool de energético esencial para que el ovocito pueda desarrollarse después de la fecundación.
Otro evento que ocurre durante la maduración ovocitaria es la expansión de las células del cúmulo que circundan al ovocito, las cuales son células especializadas de la granulosa asociadas metabólicamente entre sí y con el ovocito. Las proyecciones de las células del cúmulo atraviesan la zona pelúcida y forman pequeñas uniones con el ovocito. Estas uniones son la única entrada de sustancias que estimulan el plasma. En el ovocito inmaduro estas células están muy compactas y durante la maduración se inicia la secreción de ácido hialurónico, el cual se deposita entre ellas separándolas y originando su expansión.
La expansión de las células del cumulo y la aparición de los cuerpos polares son los síntomas más significativos de que la maduración del ovocito sigue un curso normal.
Existe una relación entre el diámetro del folículo y el desarrollo del ovocito y su capacidad de desarrollo in vitro. Así ovocitos procedentes de folículos pequeños (1-2 mm) logran la maduración nuclear pero son inmaduros citoplasmáticamente.
De otra parte ovocitos procedentes de folículos medianos (2-5 mm) o grandes (5-8mm) tienen un mayor porcentaje de lograr la maduración nuclear y alcanzar el estado de blastocisto. La competencia meiótica aparece cuando el ovocito alcanza el 80-90% de su tamaño, pero hasta, que no alcanza su tamaño máximo no puede completar la maduración citoplasmática.
La tasa de maduración nuclear aumenta con el diámetro del ovocito, lo que sugiere que los ovocitos con diámetro inferior a 110 µm están aún efectuando la síntesis de ARN y por consiguiente todavía se encuentran en fase de crecimiento y por consiguiente no han completado la maduración nuclear y citoplasmática en el momento de la FIV. Cuando el diámetro ovocitario supera los 110 µm la mayoría de los ovocitos se desarrollan hasta MII.
Se aprecia la relación existente entre el tamaño del folículo y el ovocito, y su capacidad para alcanzar su desarrollo a MII.
Todos estos eventos que tienen lugar normalmente en el animal, deben llevarse a cabo a nivel de laboratorio durante el proceso de Maduración IV.
Una vez seleccionados los ovocitos son colocados en un medio de maduración e incubados a 38°C durante 24 horas en un ambiente de alta humedad, 5% de CO2 y protegidos de la luz. Una vez trascurridas las 24 horas de la MIV, los ovocitos maduros (MII), están preparados para su fecundación.
Medios de cultivo
Para que se efectúen a nivel de laboratorio las diferentes etapas de maduración, desarrollo y fertilización del ovocito, así como la evolución del embrión y su capacidad de ser transferido, es necesario contar con medios de cultivo celular adecuados, cuyos requerimientos fisiológicos para el mantenimiento y desarrollo de los embriones son fundamentales y sus márgenes de variación reducidos.
En un principio los investigadores y profesionales de asistencia técnica reproductiva, preparaban sus propios medios de cultivo en laboratorios adecuados al respecto, lo cual hace costoso y dispendioso los diferentes procedimientos.
En la actualidad diferentes casas comerciales producen y distribuyen los medios básicos de cultivo, los que pueden restituirse poco antes de ser utilizados o ser refrigerados y almacenados por periodos variables, según el caso. Estos medios contienen en general sustancias como:
1.- Iones inorgánicos: Sus funciones son catalíticas y fisiológicas.
2.- Fuentes de energía como el lactato, piruvato y glucosa.
3.- Aminoácidos: Intervienen en la síntesis proteica, sirven como fuente de energía, como tampones intracelulares del pH y regulación del desarrollo embrionario.
4.- Vitaminas: Juegan un papel importante en el metabolismo de los hidratos de carbono y los aminoácidos, como coenzimas.
5.- Elementos orgánicos como fuente adicional de proteínas:
Suero Bovino (SB) – Albúmina Sérica Bovina (BAS): Su calidad y composición química depende del tipo y estado del donante, suero fetal bovino (SFB), suero de ternero recién nacido, suero de novillo, suero de vaca en celo (SVC).
Los efectos benéficos de la adición del suero o la albúmina son:
- Protección de las células reproductivas y embriones en cultivo, de sustancias toxicas como los metales pesados.
- Aportar hormonas y factores de crecimiento.
- Reducción de la tensión superficial del medio, evitando que los embriones se adhieran a los dispositivos, como placas de cultivo, pipetas, tubos, etc. (Mucci).
- Hormonas: Las hormonas inciden notoriamente en el desarrollo embrionario, siendo benéficas sobre el complejo cúmulo-ovocito completando la maduración meiótica. Diversos autores han adicionado hormonas como LH, FSH y 17β Estradiol a los medios de maduración y desarrollo de los ovocitos, con el fin de lograr un mayor número de embriones transferibles. Recientemente se ha empleado como sustitutos de ellas el Líquido Folicular (LFb) y el Fluido Oviductal Sintético modificado (SOFm). El LFb contiene esteroides, glucosaminoglicanos y metabolitos sintetizados por las células de la teca folicular.
- Antibióticos y antimicóticos: Simultáneamente los medios de cultivo son complementados con antibióticos y antimicóticos, con el fin de suprimir el crecimiento de microorganismos contaminantes.
Otros requisitos del medio de cultivo están relacionados con:
Agua = Se emplea como diluyente de los componentes del medio, recomendándose la utilización de agua Bidestilada (BD) o tridestilada. Actualmente se emplea el sistema de purificación mediante osmosis reversa. Su grado de pureza está fuertemente relacionada con el desarrollo embrionario.
pH = El pH debe estar entre 7.2 y 7.4 para cultivo, mientras que para el medio de fecundación se recomienda un pH superior 7.6 – 7.8.
Osmolaridad = La osmolaridad óptima en el medio de cultivo debe estar entre 275 y 285 mOsm.
Dióxido de carbono (CO2) y tensión de Oxígeno (O2) = Las condiciones habituales para la maduración y fertilización del ovocito son 5% de CO2 y 95% de aire. El CO2 es necesario para la regulación del pH intracelular. Para el desarrollo embrionario CO2 5%, O 5%, N 90%.
Temperatura = La temperatura de cultivo utilizada en general por los investigadores es de 38.5°C con 100% de humedad.
Conservación = Almacenamiento en refrigeración entre 2 – 6°C
Signos de alteración = Cambios de coloración
Presencia de grumos o precipitado
Insolubilidad
Durante este proceso los ovocitos maduros colocados previamente en cajas con 4 depósitos en medio de cultivo, reciben una concentración adecuada de espermatozoides con motilidad progresiva previamente seleccionados para que se produzca la fecundación.
Este proceso requiere de los siguientes pasos:
1.- Separación de los espermatozoides móviles de la muestra a tratar.
2.- Capacitación espermática
3.- Fecundación propiamente dicha.
Nota: Seguir contenido en artículo “Separación de espermatozoides: cómo se hace»: sección BIOTECNOLOGIA
Miguel Germán Rivera Gaona – MVZ, Esp. Reproducción
