Se vienen realizando importantes avances en el sistema de producción in vitro de embriones (PIVE) en bovinos, los cuales buscan mejorar el rendimiento de las distintas etapas del proceso a través de múltiples estrategias.
En términos generales, estas etapas de producción in vitro de embriones son:
• Obtención de los ovocitos
• Maduración de los ovocitos
• Fertilización
• Desarrollo embrionario
Obtención de los ovocitos
Los ovocitos destinados a producción in vitro de embriones (PIVE) pueden ser obtenidos de:
- 1) ovarios de animales vivos mediante la aspiración folicular o castración (ovariectomizadas), o
- 2) post mortem (matadero principalmente).
En ambas alternativas, los ovocitos son obtenidos a partir de folículos no mayores de 8 mm para evitar incorporar material de folículos que han iniciado el proceso de atresia.
En el caso de la aspiración folicular, los folículos son aspirados por medio de la visualización del ovario por ultrasonografía.
La aspiración folicular de donantes vivas por intermedio de un ecógrafo es una técnica no quirúrgica por la cual pueden obtenerse ovocitos en un breve período de tiempo.
La técnica consiste en inmovilizar al animal y colocar el transductor del equipo en la vagina de la hembra, el cual lleva incorporada una aguja. Con esta aguja pueden aspirarse los folículos del ovario sostenido por vía rectal. Mediante un sistema de vacío es posible recuperar el líquido folicular junto con el ovocito. Este material es rápidamente filtrado para iniciar la búsqueda bajo estereomicroscopio.
Con los ovarios provenientes de hembras castradas es posible proceder de diversas maneras; la más común es la aspiración de los folículos con jeringa o con sistemas de vacío. Las otras técnicas son la disección de los folículos y el corte de la superficie ovárica. En cuanto a cantidad de ovocitos competentes para ser puestos en cultivo, en orden decreciente, se encuentran el corte ovárico, la disección folicular y la aspiración folicular (en promedio de varios autores respectivamente 20, 15 y 10 ovocitos, por ovario).
Sin embargo, las técnicas de corte ovárico y disección folicular consumen entre tres y cuatro veces más tiempo que la de aspiración folicular por bomba de vacío, por lo que esta metodología es la más utilizada por los laboratorios. Los ovocitos recuperados son evaluados morfológicamente, clasificados y cultivados para proseguir con su maduración.
Maduración de los ovocitos para producción in vitro de embriones
La “maduración meiótica” se define como el período en que el ovocito reanuda la meiosis (interrumpida en estado dictioteno de la profase I) hasta el estadio de metafase II.
En este estado, los ovocitos adquieren la competencia para ser sometidos a una fertilización normal y seguir un adecuado desarrollo embrionario.
Los ovocitos provenientes de folículos antrales acompañados por las células del cúmulus (COC) pueden madurar in vitro, después de 22 horas aproximadamente, en un medio de maduración y ambientes óptimos.
Alrededor del 90% de los ovocitos inmaduros alcanza su maduración cuando las condiciones de cultivo fueron las apropiadas.
Fertilización para producción in vitro de embriones
Alrededor de 20-24 h después de colocar los ovocitos en el medio de maduración, se procede a cocultivar los ovocitos ya maduros con los espermatozoides.
Estos provienen en general de eyaculados que han sido sometidos al proceso de congelación, por lo que la primera etapa en la preparación de los espermatozoides consiste en su separación de los componentes del medio de congelación y la eliminación de la mayor parte de los espermatozoides muertos.
Para ello existen metodologías de laboratorio bien definidas que permiten que una dosis de semen (pajuela) comercial sea suficiente para inseminar más de mil ovocitos.
Los espermatozoides también deben ser tratados con factores capacitantes para que adquieran la habilidad de fecundar a los ovocitos maduros.
La interacción espermatozoide-ovocito en la placa de fertilización sucede en un microambiente muy pequeño (<50 μl para donantes aspiradas y <200 μl para ovocitos de matadero).
El número mínimo necesario de espermatozoides por ovocito no está definido debido a su gran variación entre toros y razas.
Generalmente, se utiliza la relación 1 millón de espermatozoides por mililitro de medio de fertilización.
Otra manera de expresar esta interacción es el número de espermatozoides por ovocito.
La relación más común es 4.000 a 8.000 espermatozoides por ovocito. En el caso de SS, usualmente una pajuela rinde 100-120 ovocitos.
La tasa de fertilización, medida como la tasa de clivaje a las 48 h pos-inseminación, oscila habitualmente entre el 70 y el 85% de los ovocitos expuestos a los espermatozoides.
Desarrollo embrionario en la producción in vitro de embriones
Cumplido el período de fertilización (16 horas en adelante), los ovocitos fertilizados son acondicionados para ser cultivados por un período de siete días hasta alcanzar el estadio de blastocisto (instancia en la que pueden ser transferidos o congelados).
Entre el 20 y el 40% de los ovocitos cultivados llegará al estadio de blastocisto.
Esta merma o bajo desarrollo embrionario tomando como referencia el alto porcentaje de ovocitos que alcanzan la maduración meiótica o nuclear no estaría acompañada por una completa maduración citoplasmática.
Como consecuencia, la competencia o capacidad del ovocito en fusionarse con un espermatozoide, formar pronúcleos, iniciar la división celular, compactación y blastulación podría verse comprometida.
Llegados a este grado de desarrollo, los embriones pueden ser transferidos o congelados.
La transferencia se realiza siguiendo exactamente los mismos pasos y procedimientos que para los embriones producidos in vivo.
La congelación de embriones PIVE es recomendada solo para embriones de alta calidad. La metodología de congelación más utilizada en la actualidad para embriones PIVE es la vitrificación, aunque el congelamiento lento (slow freezing) está ganando adhesiones nuevamente.
Luis Ferré1 y Luciano Cattaneo2
1 INTA Rafaela, Santa Fe.
2 Facultad Ciencias Veterinarias, UNL, R Santa Fe.
